贞观八年（634年），长孙皇后陪同太宗在九成宫避暑期间，身染重疾。皇太子请求大赦并度人入道，为妻子健康忧虑的唐太宗立即应允，但遭到长孙皇后的坚决反对，无奈唐太宗只好请普光寺法师昙藏入宫为妻子祈福，或是天子诚意所致，长孙皇后病情旋即康复。
九年（635年）皇太子李承乾纳妃苏氏，然而喜悦之后却连接着悲伤，此后接踵而来的生身母亲赵国太夫人的薨逝以及太上皇李渊的驾崩，给长孙皇后和李世民这对夫妻又一次沉重打击。双重丧期的哀痛，诱发了长孙皇后早年罹患并时常发作的气疾（疑似為現代醫學稱氣喘病又叫哮喘病），次年，病势加重，药石皆不见效。
早年，太宗驾幸太原，长孙皇后生病，他曾亲自到石壁寺礼谒禅师，并解众宝名珍，为妻子供养启愿。 于是太宗决定再次求助于佛家。十年四月，李世民下诏修复天下名胜古寺392座为皇后祈福，著名的善寂寺，修定寺便在此列。虽然太宗期待佛家的福祉能够又一次给妻子带来好运，但是，幸运没有再次眷顾。
貞觀十年（636年）六月己卯，长孙皇后崩逝于太极宫立政殿，時年三十六。其年十一月庚寅，葬於昭陵。太宗悲伤不已，遵从皇后遗愿，营山为陵，是为昭陵。纵观长孙皇后的一生，她与太宗从少年结发，一起互相扶持，走过了二十三载，于情伉俪情深，于政相辅相成，一与之齐，终身不改。
长孙皇后曾著书《女则》共十篇，辑录历代妇女事迹，作为效法古贤之鉴，已佚。今存诗一首：“上苑桃花朝日明，兰闺艳质动春情。井上新桃偷面色，檐边嫩柳学身轻。花中来去看舞蝶，树上长短听啼莺。林下何须远借问，出众风流旧有名。”她死后与唐太宗合葬于昭陵。
长孙皇后在位期间，积极履行皇后职务，曾两次行先蚕礼。[13]